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Blockkurs Versuche

Blockkurs Versuche

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Hauptversuch 1: Staphylokokken-Diagnostik - IMMIP

 

  • Methoden zur Typisierung von Staphylokokken:

    Zur Zeit breiten sich innerhalb Deutschlands Infektionen durch antibiotikaresistente Staphylococcus aureus-Stämme aus. Diese Erreger treten meist innerhalb von Krankenhäusern, besonders auf Intensivstaionen auf. Da Staphylokokken sehr widerstandsfähig gegen Austrocknung sind und auch gesunde Personen besiedeln können, werden diese Stämme auch über das Personal oder Gegenstände wie Telefonhörer von Patient zu Patient übertragen. Deshalb ist es für die Bekämpfung der Infektionen wichtig, die Übertragungswege aufzudecken und einzelne Staphylokokkenstämme wiederzuerkennen bzw. zu unterscheiden. Diese Untersuchungen geschehen durch verschiedene Verfahren; u. a. werden in unserem Institut die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), spa-Typisierung und Phagentypisierung eingesetzt, mit der sich die in Deutschland verbreiteten Epidemiestämme identifizieren lassen. Zur PFGE werden die Staphylokokkenzellen angezogen, in Agaroseblöcke eingebettet, die chromosomale DNA durch Verdau mit Lysostaphin und Proteinase K gereinigt und mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut. Die Restriktionsfragmente werden dann über ein besonderes Elektrophoreseverfahren in einem elektrischen Feld wechselnder Richtungen unter Kühlung ca. 24 h aufgetrennt. Nach einer Färbung werden die Bandenmuster verglichen und anhand eines Standards die Molekulargewichte bestimmt. Innerhalb des Praktikums wollen wir den ganzen Versuch durchführen und vorzugsweise Staphylokokkenstämme einsetzen, die aus der Flora der Teilnehmer stammen. Die Phagentypisierung wird anhand der Stämme der Teilnehmer demonstriert. Eine weitere vorgestellte Typisierungsmethode ist die spa-Typisierung. Hierbei wird ein PCR-Produkt des Gens für das Protein A (spa) hergestellt und sequenziert. Dieses Gen enthält multiple Repeats, die sich bei nicht verwandten Stämmen unterscheiden. Über ein computergestütztes numerisches System können die Staphylokokkenstämme anhand der Sequenz der Repeats zugeordnet werden.

  • PCR gegen mecA:

    Phänotypisch methicillinresistente S. aureus können in zwei Gruppen unterteilt werden. Die MRSA-Stämme (methicillin-resistant S. aureus) besitzen das Gen mecA, welches für PBP2a, ein neues Penicillinbindeprotein kodiert. PBP2a hat eine sehr geringe Affinität zu Methicillin, so daß es durch das Antibiotikum nicht gehemmt werden kann. Mit Hilfe des PBP2a kann die Peptidoglykan-Synthese in Anwesenheit von Methicillin aufrecht erhalten werden, so daß die Zellen überleben.
    Die BORSA-Stämme (borderline resistant S. aureus) verfügen nicht über dieses zusätzliche PBP, sondern sind aufgrund einer beta-Lactamase (Methicillinase) oder anderer Mechanismen resistent gegen vergleichsweise geringe Methicillinkonzentrationen. Die MRSA-Stämme der ersten Gruppe können, aber müssen nicht hochresistent sein. Durch Nachweis des mecA-Genes können sie von den BORSA-Stämmen unterschieden werden. Der Gennachweis erfolgt mit Hilfe der PCR.


Hauptversuch 2: Staphylococcus aureus alpha-Toxin: Reinigung und Wirkungsweise - IfMB

 

    Staphylococcus aureus produziert zahlreiche extrazelluläre Substanzen, die für die Entstehung von Erkrankungen des Wirtsorganismus wichtig sind. Zu diesen Pathogenitätsfaktoren gehören u. a. Enterotoxine, exfoliatives Toxin, TSST-1 (Toxic Shock Syndrome Toxin 1), Koagulase, Oberflächenproteine sowie Hämolysine. Das pathogenetisch wichtigste Hämolysin ist das alpha-Toxin, ein 34 kDa großes, wasserlösliches Exoprotein, welches vor allem wegen seiner starken Wirkung auf Kaninchenerythrocyten in diese Gruppe eingeordnet wurde. Neben seiner hämolytischen Aktivität zeigt das alpha-Toxin cytotoxische und lethale Effekte, die sich vor allem gegen menschliche Thrombocyten richten.
    Das alpha-Toxin entfaltet seine Aktivität an der Membran der Zielzelle. Mehrere Toxinmoleküle binden dabei an die Membran und bilden hexamere Transmembrankanäle mit einem Durchmesser von 2-3 nm. Kleine Ionen gelangen so nach außen, und es kommt zur osmotischen Lyse.
    Im Praktikum wollen wir das alpha-Toxin aus dem Kulturüberstand von Staphylococcus aureus Wood 46 gewinnen und über Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie und Ultrafiltration aufreinigen. Eine Reinheitskontrolle erfolgt über SDS-PAGE. Anschließend wollen wir die Wirkung des Toxins an Liposomen untersuchen und die Porenbildung über Fluoreszenzspektrometrie verfolgen.



Hauptversuch 3: Antibiotika - Lantibiotika - IMMIP

 

  • Screening auf Lantibiotika-produzierende Stämme:

    Bacteriocine sind antibiotisch aktive Proteine oder Peptide, die im Gegensatz zu breit wirkenden niedermolekularen Antibiotika ein enges, auf verwandte Arten beschränktes Aktivitätsspektrum besitzen. Praktisch alle Bakterienarten vermögen Bacteriocine zu produzieren, und man stellt sich vor, daß sie eine wichtige Rolle spielen bei der Besetzung ökologischer Nischen. Das gilt auch für medizinisch relevante Bakterien und die Mikroökologie bestimmter Körperbereiche; insofern können Bacteriocine z.B. pathogener Bakterien indirekte Pathofaktoren darstellen, bzw. Bacteriocine von Bakterien der physiologischen Körperflora bei der Abwehr von exogenen Infektionserregern eine Rolle spielen.
    Wie bei Gram-positiven Bakterien üblich, sind die Bacteriocine der Staphylokokken meist kleinere Peptide, die häufig posttranslational modifiziert werden, wie z.B. die Lanthionin-haltigen antibiotischen Peptide, kurz Lantibiotika genannt. Im Praktikum sollen in diesem Versuch zunächst alle Staphylokokkenstämme, die von den Teilnehmern bei der Untersuchung ihrer Flora gefunden werden, gesammelt und im Agar-Stich-Verfahren auf ihr Produktionsvermögen getestet werden. 

  • Identifizierung eines Lantibiotikums durch MALDI TOF Massenspektrometrie:

    Ein weitgehend gereinigtes Lantibiotikum, dessen Struktur bekannt ist, soll durch MALDI-TOF MS identifiziert werden.
  • Identifizierung von Mikroorganismen  der eigenen Flora mit MALDI-TOF Massenspektrometrie:

    Mikroorganismen zeigen ein charakteristisches MALDI-TOF "fingerprint" Spektrum, anhand dessen eine schnelle und zuverlässige Identifizierung erfolgen kann.

 

  • Klonierung eines Antibiotikaresistenzgens:

    QacA ist ein Multidrugtransporter, ein in der Membran lokalisiertes Enzym, das in der Lage ist, mono- und divalente organische Kationen wie Benzalkoniumchlorid, Ethidiumbromid und Chlorhexidin aus der Membran herauszutransportieren und die Zelle so vor den toxischen Substanzen zu schützen. QacA besteht aus 14 Transmembransequenzen, dazwischen befinden sich 6 Loops im Cytoplasma und sieben Loops im extracytoplasmatischen Raum. Das Substrat wird auf der inneren Seite der Membran gebunden und unter ATP-Verbrauch nach außen transportiert.

    In dem Versuch wollen wir das plasmidcodierte qacA mit seinem Regulatorgen qacR in den Escherichia coli-Staphylococcus shuttle vector pCU1 (4,95 kb) klonieren.

 

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